El río Ardila, la mina de Castillejos en Zafra, las cuevas de Alconera, las dehesas de Jerez, el embalse de Valuengo y las colonias del cernícalo primilla en Zafra, son zonas protegidas que se pueden ver afectadas por la construcción de la autovía entre Zafra y Huelva.
El ciprés calvo de Mimbre (Fregenal de la Sierra) es un árbol catalogado como singular que aparece en el ámbito de estudio del futuro trazado
En el estudio informativo se ha definido un corredor básico, que sigue el itinerario básico de la N-435, que une las localidades de Zafra y Fregenal de la Sierra y que continúa hasta el límite de la provincia de Huelva. Este corredor, según el estudio, presenta una alternativa diferente, que parte desde la conexión de la futura autovía entre Zafra y Jerez de los Caballeros siguiendo el eje central de la EX-101, y que después se apoya en el actual ferrocarril entre Zafra y Huelva para atravesar el parque natural de la Sierra de Aracena. Además, se ha definido otro corredor alternativo, que también pretende aprovechar la actual infraestructura ferroviaria, y que discurre paralelo al corredor principal por el oeste hasta unirse a él en Valverde del Camino.
